2024 诺贝尔生理学或医学奖：microRNA 开启基因调控新维度

2024 年诺贝尔生理学或医学奖的颁布，再次吸引了全球科学界的目光。今年，这一殊荣授予了两位科学家：Victor Ambros和Gary Ruvkun，他们因发现microRNA及其在基因转录后调控的作用，获得2024年诺贝尔生理学或医学奖。

图1 2024年诺贝尔生理学或医学奖获奖者，Victor Ambros和Gary Ruvkun

microRNA 的发现过程

故事要从 20 世纪 80 年代末说起，Ambros和Ruvkun一直在研究秀丽隐杆线虫（现在都已成为模式生物了）的生命进程，他们将目标锁定在了两个突变株 “lin-4” 和 “lin-14”上。Ambros惊奇地发现，lin-4 基因仿佛是 lin-14 基因的神秘 “负调控者”，但其中的抑制机制却如同笼罩在一层迷雾之中，让人捉摸不透。

时光流转，Ambros直到博士后生涯结束，才在哈佛大学的实验室里意外迎来了重大突破。他发现，lin-4 基因抑制 lin-14 基因的原因，极有可能是 lin-4 产生的一种超短 RNA。与此同时，Ruvkun也有了惊人发现，他察觉到 lin-4 并不影响 lin-14 基因产生mRNA，而是阻止 mRNA 产生蛋白质。并且，他还找到了 lin-14转录mRNA 上的一个关键位置，这个位置就是 lin-4 对其进行抑制的结合位点。

当Ambros和Ruvkun交流彼此的发现后，一个具有突破性的结论诞生了：lin-4 中的超短 RNA 与 lin-14 中 mRNA 的关键片段序列互补，正是通过这种奇妙的结合，超短 RNA 如同一个“开关”，“关闭”了 lin-14基因的表达，阻止它产生蛋白质。这一发现，揭开了以前从未被知晓的、基于 microRNA 的基因调控机制。因为在此之前，科学家们一直认为是一种名为 “转录因子” 的特殊蛋白质，通过与 DNA 的特定区域结合，来决定产生哪些 mRNA，从而实现基因调控。

图2  Ambros和Ruvkun发现lin-4来源的microRNA过程

如今，人体内超过一千种 microRNA 已被发现。可以毫不夸张地说，没有它们，细胞和组织就无法正常发育，而它们的异常和突变甚至可能引发癌症等严重疾病。microRNA 的出现，就像是为生命的基因调控世界打开了一扇全新的大门，揭示了一个全新的维度，它对所有复杂的生命形式都至关重要。

图4 自1993-2000发现microRNA开始的microRNA研究进程

microRNA 的应用

近些年来由于对microRNA研究的比较多，我们知道microRNA 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子。它通过与靶 mRNA 结合，抑制其翻译或促进其降解，从而在转录后水平调控基因表达。

图5 microRNA的开创性发现揭示了基因调控的一个新维度

医学领域

在医学领域，microRNA 展现出了巨大的潜力，可作为疾病的重要生物标志物。例如，众多研究已表明，在某些癌症中，特定的 microRNA 表达水平会发生显著变化。Lan 等人在权威期刊《Biomedical Research International》发表的论文中深入探讨并强调了 microRNA 作为癌症潜在生物标志物的重大意义。以肝癌为例，大量研究发现，在不同类型的癌症（肺癌、肝癌、结直肠癌等）患者中，不同的microRNA的表达水平有非常明显的变化。通过对血液中microRNA含量的精准检测，能够为癌症的早期诊断提供极为重要的参考依据。

同时，microRNA 为疾病治疗开辟了新的策略。Krützfeldt 等人在国际著名期刊《Nature》发表的研究中，创新性地介绍了 “antagomirs” 这种反义寡核苷酸，它可在体内有效地沉默 microRNA。通过使用特定的 microRNA 模拟物或抑制剂，可以精准地调节相关基因的表达，进而为疾病治疗带来新的希望。在一些癌症的治疗研究中，科学家们积极探索使用 microRNA 抑制剂来抑制肿瘤细胞的生长和扩散。例如，针对某些特定类型的癌症，研究人员发现特定的 microRNA 抑制剂能够靶向作用于肿瘤细胞中的关键基因，从而抑制肿瘤细胞的增殖和转移，为癌症治疗提供了新的思路和方法。

农业领域

在农业领域，microRNA 在植物的生长发育和抗逆性中起着至关重要的作用。Tang 和 Chu 在《Nature Plants》发表的文章中，系统地强调了 microRNA 在作物复杂性状改良中的重要意义。通过调控植物中的 microRNA 表达，可以有效地改良农作物的品质和产量。比如，在面对干旱、盐碱等不良环境时，调节与植物抗逆性相关的 microRNA，可以显著提高农作物的耐受性。此外，还可以利用 microRNA 技术来培育具有特定性状的转基因农作物。Zhou 和 Luo 的研究深入探讨了 microRNA 介导的基因调控在植物基因工程中的潜在应用。通过对特定 microRNA 的调控，可以实现对农作物生长发育过程的精准干预，培育出具有高产、优质、抗逆等优良性状的农作物品种，为农业生产的可持续发展提供了新的技术手段。

研究方法

那么如何研究 microRNA 呢？ 常用的实验方法和技术手段也是丰富多样的，下面跟大家介绍一些常用的实验研究方法。

① Northern Blot

这是一种经典的 RNA 检测方法。通过电泳将 RNA 分离，然后将其转移到膜上，利用特定的 microRNA 探针进行杂交，检测 microRNA 的表达水平。虽然该方法相对较为繁琐，但具有较高的特异性和准确性。

图6 Northern Blot检测的灵敏度和准确性

② 基因芯片技术

这是一种高通量的检测方法，可以同时检测大量 microRNA 的表达水平。通过将已知的 microRNA 探针固定在芯片上，与样本中的 microRNA 进行杂交，然后利用荧光或其他信号检测技术，快速获取样本中 microRNA 的表达谱。这种方法能够全面地了解不同生理或病理状态下 microRNA 的变化情况，为研究 microRNA 的功能提供重要线索。这种方法成本较高；可能存在假阳性和假阴性结果；对样本的质量和数量要求较高。

③ 实时定量 PCR（RT-qPCR）

该方法可用于特定 microRNA 的定量分析。它具有高灵敏度和特异性，能够准确地检测出微量的 microRNA。通过设计针对特定 microRNA 的引物和探针，利用 PCR 技术对 microRNA 进行扩增，并实时监测扩增过程中的荧光信号变化，从而计算出 microRNA 的相对或绝对表达量。由于其操作相对方便，方法简单，通量高，已经成为实验室里面常用的一种检测microRNA的方法了。

这种方法首先要把 RNA 提取出来，microRNA 的 qPCR 的检测与正常的基因无明显差异，但由于 microRNA 比较小，所以需要的特殊的反转录方法。常用的反转录方法有两种，一种为茎环法（Stemloop specific primer），一种为加尾法（Universal primer）。

图7 microRNA常见的2种反转录的方式

④ RNA 干扰技术

这是一种研究 microRNA 功能的有力工具。通过导入特定的小干扰 RNA（siRNA）或 microRNA 抑制剂，可以特异性地抑制目标 microRNA 的功能。相反，使用 microRNA 模拟物可以增强 microRNA 的活性。通过观察细胞或生物体在 microRNA 功能改变后的表型变化，可以推断出 microRNA 的生物学功能。

⑤ 生物信息学分析

随着高通量测序技术的发展，产生了大量的 microRNA 序列数据。生物信息学方法可以用于分析这些数据，预测新的 microRNA、识别 microRNA 的靶基因以及研究 microRNA 的进化和功能保守性。例如，利用序列比对算法，可以在不同物种中寻找保守的 microRNA，从而揭示 microRNA 在进化过程中的重要作用。

⑥ 细胞和动物模型实验

构建细胞和动物模型是研究 microRNA 功能的重要手段。通过在细胞系中过表达或抑制特定的 microRNA，可以观察细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程的变化。在动物模型中，可以通过基因敲除、转基因等技术来研究 microRNA 在体内的功能。例如，构建 microRNA 敲除小鼠模型，可以研究特定 microRNA 在小鼠发育、生理和疾病中的作用。

图8 整体原位microRNA 杂交（Whole-mount miRNA ISH）技术在生物发育中的应用

⑦ microRNA 活性检测方法

• 报告基因法：构建含有 microRNA 靶序列和报告基因（如荧光素酶基因）的载体，当 microRNA 与靶序列结合时，会抑制报告基因的表达。通过检测报告基因的活性变化，可以间接反映 microRNA 的活性。其中荧光素酶报告系统由于操作简单、灵敏度高，已广泛的应用于microRNA的活性及靶标检测。更详细的方法可以参看下方的视频。

复制下方链接，可查看完整视频

https://www.transgen.com/technology_video.html

• Western blot 检测靶蛋白法：microRNA 通过与靶 mRNA 结合抑制其翻译，从而降低靶蛋白的表达水平。通过 Western blot 技术检测靶蛋白的表达量变化，可以推断 microRNA 的活性。

• RNA 结合蛋白免疫沉淀法（RIP）：利用抗体特异性地结合与 microRNA 结合的 RNA 结合蛋白，然后通过免疫沉淀分离出与该蛋白结合的 RNA，包括 microRNA 和其靶 mRNA。通过检测沉淀下来的 RNA 中 microRNA 和靶 mRNA 的含量，可以分析 microRNA 的活性及其与靶 mRNA 的结合情况。

TransGen 相关产品

EasyPure^® miRNA Kit

小 RNA 提取试剂盒 (ER601)

产品特点

★ 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿

★ 适用于从细胞、组织、新鲜血液、外泌体中提取 miRNA 和 Total RNA

★ 通过调整加入水相中无水乙醇的用量，可获得：

1. RNA 离心柱吸附大分子量 RNA(28S rRNA, 18S rRNA, mRNA) 后，将流出液 ( 包含小于 200 nt 的 RNAs, 如 miRNA,siRNA, shRNA, snRNA 等 ) 再经 miRNA 离心柱吸附 Small RNA；

2. RNA 离心柱吸附所有 RNA( 包含小于 200 nt 的 RNA)

★ 裂解能力强、提取量高、应用范围广

数据展示

分别用 miRNA 提取产品提取 miRNA，2 个重复，用 miRNA 反转录产品反转后进行 qPCR 检测

TransZol Up

强化 RNA 提取试剂盒 (ET111)

产品特点

与其它总 RNA 提取试剂相比，裂解能力强、速度快，RNA 的提取量与纯度更高。

• 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿

• 适用于快速提取多种组织和细胞中的总 RNA

• 应用范围广：动物、植物组织、血液和细菌等样品。小量样品 (50-100 mg 组织、5×106 细胞、200 μL 血液 )。大量样品 ( ≥1 g 组织或 ≥107 细胞 )

• 提取速度快：一个小时内可完成反应

• 操作可视化：溶液呈粉红色，便于分离水相和有机相

• 提取纯度高：DNA 和蛋白质的污染低

• RNA 溶解液：便于 RNA 保存和降低对反转录反应的抑制

数据展示

TransScript^® miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

TransScript miRNA cDNA 第一链合成试剂盒 (AT351)

产品特点

★ 适用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的样品反转录

★ 优化的加尾酶和反转录酶配比及反应缓冲液，确保 miRNA 的反转录效率

★ Poly(A) 加尾和 cDNA 合成在同一反应体系中一步完成

数据展示

▶ 批次间稳定性好

使用不同批次产品分别以从人血浆中提取的 miRNA 为模板，进行 qRT-PCR 检测，根据 Cq 值变化判断该产品批次间的稳定性。

▶ 反转录效率高

使用 TransGen 和 Company TA 产品，分别以从人血浆中提取的miRNA 为模板，进行 qRT-PCR 检测，根据 Cq 值变化分析反转录效果。

TransScript^® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix

TransScript 一步法 gDNA 去除及 cDNA 合成试剂盒 (AT311)

产品特点

★ 在同一反应体系中，同时完成反转录与基因组 DNA 的去除，操作简便，降低污染几率

★ 产物用于 qPCR：反转录 15 分钟；产物用于 PCR：反转录 30 分钟

★ 反应结束后，同时热失活 RT/RI 与 gDNA Remover

★ 合成片段 ≤12 kb

数据展示

▶ 反转录效率高

▶ 高效基因组去除

使用不同批次产品分别以人 100 ng 总 RNA、人 100 ng 总 RNA+200 ng gDNA、200 ng gDNA 为模板，进行 RT-PCR 检测，1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析模板 DNA 去除效果；qRT-PCR 检测 18S DNA 表达量。

PerfectStart^® Green qPCR SuperMix

染料法荧光定量预混试剂（AQ601）

产品特点

★ 3 种抗体封闭，特异性高，灵敏度高，扩增效率强，适用物种范围广

★ 双阳离子缓冲液，增强特异性，减少引物二聚体形成，数据准确

★ 配有适用于不同机型的 Universal Passive Reference Dye ( 调整 PCR 加样误差引起的管间差异 )，校正孔间信号误差

数据展示

▶ 扩增效率高

以梯度稀释的质粒 DNA (10 ng ～ 0.1 pg，10 倍稀释 ) 为模板进行扩增得到的扩增曲线和标准曲线。结果显示，TransGen 产品扩增效率较高，可得到漂亮的扩增曲线和标准曲线。

▶ 不同物种模板扩增

以不同物种的 RNA 反转录 (TransGen, AT311) 后得到的 cDNA 为模板分别使用 TransGen 与 Company T 的产品进行扩增 (NTC 无扩增 )。结果显示，TransGen 产品扩增效果与 Company T 产品基本一致。

产品信息

精选文献

• Duan H J, Chu H Q, Cao T M, et al. Investigation of the cell composition and gene expression in the delayed-type hypersensitivity tuberculin skin test[J]. Military Medical Research, 2023. 使用产品TransZol Up (ET111)

• Wang D, Xu C, Yang W, et al. E3 ligase RNF167 and deubiquitinase STAMBPL1 modulate mTOR and cancer progression[J]. Molecular cell, 2022. 使用产品TransZol Up (ET111)

• He X, Yang L, Huang R, et al. Activation of CB2R with AM1241 ameliorates neurodegeneration via the Xist/miR‐133b‐3p/Pitx3 axis[J]. Journal of cellular physiology, 2020. 使用产品EasyPure^® miRNA Kit (ER601)

• Huang R, Jia B, Su D, et al. Plant exosomes fused with engineered mesenchymal stem cell‐derived nanovesicles for synergistic therapy of autoimmune skin disorders[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2023. 使用产品TransScript^® miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

• Zhao J, Zeng X, Liu J, et al. Marasmius androsaceus mitigates depression-exacerbated intestinal radiation injuries through reprogramming hippocampal miRNA expression[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2023. 使用产品TransScript^® miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

• Gong Q, Wang Y, He L, et al. Molecular basis of methyl-salicylate-mediated plant airborne defence[J]. Nature, 2023. 使用产品TransScript^® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix

• Wan W, Dong H, Lai D H, et al. The Toxoplasma micropore mediates endocytosis for selective nutrient salvage from host cell compartments[J]. Nature communications, 2023. 使用产品TransScript^® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis

• Bing C, Kangyu J, Jingyi D, et al. LuHypocretin-1/hypocretin receptor 1 regulates neuroplasticity and cognitive function through hippocampal lactate homeostasis in depressed model. Advanced science, 2024. 使用产品PerfectStart^® Green qPCR SuperMix

• Zhang B, He P, Lawrence J E G, et al. A human embryonic limb cell atlas resolved in space and time[J]. Nature, 2023. 使用产品PerfectStart^® Green qPCR SuperMix

展望

对 microRNA 的未来研究充满期待。在研究方向上，科学家们将进一步深入探索 microRNA 在不同生理和病理过程中的作用机制，以及与其他基因调控因子的相互关系。在疾病治疗方面，有望开发出基于 microRNA 的新型药物，为癌症等严重疾病的治疗带来新的突破。同时，随着技术的不断进步，对 microRNA 的检测和调控方法也将更加精准和高效。

涉及到的参考文献

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